日本国立研究开发法人理化学研究所（简称，理研）脑神经科学研究中心的村山正宜团队总监、基础科学特别研究员大本育实，东京大学研究生院综合文化研究科的大泉匡史副教授、博士研究生清冈大毅，横滨市立大学研究生院数据科学研究科的北园淳副教授，生理学研究所行为与代谢分子解析中心的小林宪太副教授等人组成的联合研究团队，运用村山团队总监等独立研发的广视野双光子显微镜，实现了小鼠大脑皮层在无意识状态（睡眠/麻醉时）与有意识状态（清醒时）下，功能性网络在单细胞级别上的差异可视化。相关研究成果已发表在《Cell Reports》期刊上。
图1 运用广视野双光子显微镜记录单细胞级别大规模脑神经活动（供图：理化学研究所）
•A：通过具备3mm×3mm视野的显微镜，同步记录大脑皮层10个以上脑区中10,000余个神经细胞的活动。各脑区以不同颜色标示。
•B：小鼠在清醒与睡眠交替状态下的脑部状态及对应神经细胞活动示例。本实验中几乎未观察到快速眼动睡眠（浅层睡眠，脑电波微弱且接近清醒状态），故未纳入分析。
•C：清醒状态与麻醉状态下神经细胞活动的对比示例。
村山正宜先生（左）与大泉匡史先生（右）（供图：理化学研究所）
即使处于无意识状态，神经细胞仍会和清醒时那样自发活动，并对外界刺激作出反应。但我们无法感知这种神经活动传递的信息。这种无意识状态下无法感知的神经机制此前一直未被阐明。
此前有功能磁共振成像（fMRI）研究报告称，无意识状态下脑区间网络结构与清醒时存在差异，呈现为子网络（具有相似活动模式的神经细胞群）分离状态。然而，由于缺乏细胞级别的分辨率，无法探究单个神经细胞在脑内是怎样构建功能性网络的，以及它们如何参与功能性网络结构的变化的。
村山团队总监等人自主研发的广视野双光子显微镜，由于能够同时记录10多个脑区内1万余个神经细胞的活动，因此能在保持单细胞级别微观分辨率的同时，实现大规模功能性网络结构的解析。
联合团队运用广视野双光子显微镜的钙成像技术，在小鼠无意识状态（睡眠/麻醉时）与有意识状态（清醒时）下，对大脑皮层神经细胞活动进行了大规模观测，并基于观测数据在细胞层面解析了功能性网络结构。村山团队总监表示：“为使小鼠在双光子显微镜下自然入睡，我们进行了反复训练。即便如此，稍有刺激，它们便不会入睡，这是实验中最为棘手的部分”。
实验结果发现，无意识状态下虽能观察到单个神经细胞的活动，但整体神经活动水平较有意识状态时显著降低。基于这些观测数据，通过数理分析提取神经细胞间的协同活动，研究团队推断出了有意识与无意识状态下的功能性网络结构。
首先，为在细胞层面把握大规模功能性网络的结构，研究聚焦于揭示网络如何通过子网络分工运作的“模块性”（网络的整合性与分离性），并探究了有意识状态与无意识状态下模块性的变化规律。模块化程度越高，意味着网络越被划分为多个子网络，而模块化程度越低，则就意味着网络越处于一个整体协同运作的状态。
分析结果表明，有意识状态与无意识状态下功能性网络的模块性存在差异。相较于有意识状态，无意识状态下子网络内部连接增强，而子网络间连接减弱，从而提升了整体模块性。这意味着功能性网络整体呈现分离状态，导致子网络间连接减弱，信息传递效率降低。该结论与功能磁共振成像（fMRI）结果相吻合。
聚焦神经细胞验证子网络的稳定性时发现，尽管各神经细胞所属的子网络会随时间变化，但并非完全随机变化，而是具有一定的时间稳定性。这表明子网络是具有特定脑功能的结构化群体。
为探究参与功能网络分离与整合的神经细胞特性，研究人员计算了构成功能网络的所有神经细胞对模块化的贡献度，及表示与其他神经细胞连接程度的度数。度数越高表明连接越强。分析结果显示，度数高的枢纽细胞虽参与网络构建，却未对意识状态引发的模块化差异产生影响。另一方面，具有中等度数的神经细胞群才是产生模块性差异的驱动者。
进一步研究大脑中子网络的空间分布后发现，无论在有意识或无意识状态下，构成各子网络的神经细胞均在不同脑区内混合分布。这种跨越脑区的神经细胞间的连接被认为与脑功能的表达密切相关。
最后，为解释功能上分离的fMRI结果与空间上混杂分布的本次结果的差异，通过平均化单个神经细胞的周边多个神经细胞活动进行空间粗粒化，并重新分析了子网络分布。结果发现，粗粒化处理后构成子网络的神经细胞群分布呈现从混杂化向局域化的转变趋势。大泉副教授表示：“由于分析对象的细胞数量极其庞大，解析过程十分艰辛，但本次研究首次实现了微观与宏观层面的衔接”。
开辟基于细胞的新型精神疾病治疗路径
运用此次开发的方法，可在单细胞层面记录网络信息，从而实现跨越微观至宏观尺度的网络结构解析。虽然已有研究表示，老年痴呆症、精神疾病等多种病症会导致脑功能网络结构改变，但通过将该方法应用于疾病模型动物，可有助于从细胞层面理解临床观察到的宏观网络变化源于何种细胞间连接变化。未来有望为疾病的早期发现及基于细胞的治疗策略制定作出贡献。
原文：《科学新闻》
翻译：JST客观日本编辑部
【论文信息】
期刊：Cell Reports
论文：Single-cell resolution functional networks during unconsciousness are segregated into spatially intermixed modules
DOI：10.1016/j.celrep.2025.116902
