作为新一代医药产品而备受关注的中分子药，在癌症及疑难病症治疗等领域蕴藏着巨大潜力。这类药物能像小分子药物一样进入体内细胞，与特定靶点结合发挥作用，然而，要测量究竟有多少药物能进入细胞、这些药物能在细胞内停留多久，目前只有既耗时又费力的复杂方法，且无法使用病变细胞进行验证。
日本九州大学研究生院理学研究院的川井隆之副教授等人的研究团队，开发出一种利用水的渗透压瞬间使细胞破裂，并快速提取细胞内成分的新方法“CyTOR”。该方法仅需简单操作，就能在短短5秒内提取出细胞内的药物，并借助液相色谱-质谱联用分析（LC-MS）实现精准测定。研究团队实际向细胞中加入4种药物后检测发现，该药物在细胞渗透性和排出性上存在差异，且差异与以往研究结论一致。该方法将成为推动药物研发高效开展的新型细胞膜渗透性测试法，相关研究成果已发表在期刊《Analytical Chemistry》上。
图1.此次开发的CyTOR法概念图。（1）在含药物的培养基中培养细胞一定时间；（2）去除外部药物，添加超纯水使细胞破裂并回收细胞质。提取液随后进行LC-MS分析，计算细胞内药物浓度（供图：九州大学）
CyTOR的操作极为简单，只需向培养细胞喷洒低渗溶液（超纯水）即可。喷洒的低渗溶液与细胞内会产生渗透压差，使细胞在短时间内破裂，从而快速提取细胞质。利用渗透压差提取细胞质中蛋白质的技术此前虽已被开发出来，但这类技术或会使用表面活性剂，或需进行长时间操作，导致存在于细胞质以外（如细胞膜）的药物也会被一同溶出。而CyTOR通过30秒的快速提取操作，能选择性提取细胞质中的药物，通过与LC-MS相结合，即可实现对细胞内药物浓度的高精度测定。
为确认能否用超纯水使细胞破裂并仅回收细胞质，研究团队首先用calcein-AM和CellMask这两种试剂处理细胞，分别对细胞质和细胞膜进行染色。然后，用超纯水使细胞破裂后发现，添加超纯水后仅5秒，细胞质标志物消失，而细胞膜标志物即使过了1分钟也几乎无变化。这一结果表明，通过CyTOR可快速且选择性地回收细胞质。
接着，研究团队从理论层面预测了向培养基中添加药物后，细胞内药物浓度随时间变化的规律，发现该变化可通过药物渗透率与时间的函数表达。通过将该函数与实际实验数据拟合并确定常数，最终可计算出药物进入细胞的难易程度（从细胞外到细胞内的膜渗透性）及排出细胞的难易程度（从细胞内到细胞外的渗透性）。
药物的进入与排出细胞的难易程度可分为三种模式：易进易出、难进易出、难进难出。研究团队分别用含有对应这三种模式的小分子药物（普萘洛尔、西咪替丁、阿替洛尔）及中分子药物环孢素A的培养基培养HeLa细胞，在不同培养时间点，对CyTOR提取后药物进行LC-MS分析。计算出相对于所添加药物的细胞内渗透比例（药物渗透率），并将其对照培养时间作图，结果显示：每种药物进入与排出细胞的难易程度，均与以往研究报告呈现高度一致的倾向，这证明利用癌细胞能够简便地测量药物渗透性。
CyTOR是一项实现了以往难以完成的细胞内药物快速、高精度定量的革新性技术。研究团队表示，今后将通过引入细胞体积自动测量技术和多药物同时分析算法，推进该方法向高通量、分析自动化方向改进。此外，CyTOR不仅可用于药物分析，还能应用于细胞内代谢物及化学探针的分析，因此有望为理解生命科学研究领域整体的分子动态提供助力。
川井副教授表示：“细胞膜是分隔细胞内外的屏障，具有允许对细胞有益的物质通过、阻止药物等异物进入的特性。确认药物是否真的渗透到了病变细胞中，这一点极为重要。在本研究中，我们通过利用此前长期被忽视的渗透压，开发出了能瞬间使细胞破裂、简便提取细胞内药物的方法。正因为操作简单，该方法是任何人都能用的有用方法，因此希望更多人都能加以运用。”
原文：《科学新闻》
翻译：JST客观日本编辑部
【论文信息】
期刊：Analytical Chemistry
论文：Quantifying Cell Membrane Permeability of Small to Mid-Size Drugs Using Quick Osmotic Cytoplasm Extraction
DOI：10.1021/acs.analchem.5c01064
