一枚芯片上汇集10万支试管,通过单分子分析解开生命的奥秘

新技术 2018年12月17日
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生物体内存在各种各样的生物分子,分别发挥着不同的作用。要想明确解释生命现象,掌握每个分子的功能和物理性质至关重要。日本理化学研究所(简称“理研”)的主任研究员渡边力也,挑战开发了在单分子测量中不可或缺的微芯片。

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理化学研究所开拓研究本部主任研究员渡边力也,手中拿的是其开发的微芯片。

查清蛋白质功能需要大量集成微型试管

要想解开生命活动的奥秘,推动疾病治疗和新药开发,了解蛋白质在生物体内发挥的作用至关重要。例如,今年的诺贝尔生理学或医学奖得主本庶佑教授发现了与免疫机制有关的蛋白质并查明了其功能,这有助于开发新的癌症治疗方法。

调查酶等蛋白质的功能时要评价其“活性”。比较常用的方法是将蛋白质溶液和与之起反应的物质(基质)放入试管,检测反应产物,通过边改变基质的浓度边进行测量,还可以调查反应速度。试管(孔槽)数量越多,在相同条件下获得的数据越多,能用较少的工作量获得更精确的数据。一般多使用设置96个孔槽的微孔板,但渡边力也想在小型芯片上设置更多的试管。他解释了这样做的目的。

“以往的实验全都假设所有蛋白质性质均一且活性相同,以这个假设为基础将整组分子作为实验对象,但这样只能得到每组分子的平均值。要想准确了解功能,需要测量单个分子的活性。而测量单个分子需要将每个蛋白质分子单独放入一个试管中,因此需要大量的微型试管”。

新开发的24×32毫米见方的微芯片上设置了10万个直径4微米、深500纳米的微型试管(图1)。将蛋白质溶液倒在芯片上时,一个试管中只进入一个蛋白质分子的情况非常少,约为1000分之1左右。蛋白质进入了哪个试管,具备什么样的活性要进行统计处理,因此要想收集所需的测量结果,必须有大量的微型试管。

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图1:在厚500纳米的氟树脂膜上形成了10万个直径4微米的微型试管的微芯片。向芯片上设置的宽2毫米、高0.3毫米的流路滴入蛋白质水溶液。从流路入口到8.1毫米处设置了试管。

渡边介绍说,试管的微细化还有助于提高活性测量的灵敏度。他说:“一个分子的蛋白质与基质发生反应获得的产物非常少。试管容积比较小的话,反应产物的浓度变化就比较大,因此,通过使用响应浓度变化的荧光试剂来捕捉荧光强度的变化,能以高灵敏度定量测量生物反应”。

利用半导体加工技术,形成模拟生物体的薄膜

制作微型试管应用了半导体微细加工技术。因基板采用疎水性氟树脂,而且容积只有数飞(1000万亿分之1)升,在表面张力的作用下,存在蛋白质水溶液难以进入试管的问题。微细加工技术也为解决这个问题做出了贡献。

渡边说:“通过用等离子对底面和侧面进行表面处理,可以将微型试管的内部变为亲水性,随着表面张力减弱,水溶液容易进入试管内。不过,微型试管的入口部分依然保持疎水性。因此,先滴入含有脂质的有机溶剂(氯仿),然后再灌水进去,通过这两道工序,可以高效形成与细胞膜相同的脂质双层膜。与以往的方法不同,膜蛋白容易嵌入脂质双层膜,可以创造更加接近生物体的条件”。

通过在试管上形成脂质双层膜盖,还可以实施嵌入膜蛋白的实验,膜蛋白发挥着转运物质等的重要作用(图2)。如果能由此查明单个分子的膜蛋白如何工作,还有望为新药开发等做出贡献。

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图2:通过把参与物质转运的膜蛋白嵌入脂质双层膜,能以单个分子为单位检测向细胞内外进行的物质转运。灵敏度非常高,能定量检测每秒约2个分子的转运。

利用浓度梯度提高实验效率

通过开发微芯片,开辟了以接近生物体的条件测量单个分子功能的道路。不过,要想实际投入使用,还需要进一步提高实验效率。由于蛋白质活性取决于基质的浓度,所以要在多种浓度条件下测量,但利用以往的微芯片,一枚芯片只能在一种条件下进行测量,必须根据浓度准备多个微芯片。渡边设法解决了这个问题。

渡边说:“我想到了利用流体的概念来制作浓度梯度。利用含蛋白质和基质的水溶液灌满流路后,以一定的流速从流路入口灌入稀释液的话,就可以沿着流动方向形成浓度梯度。类似于在河流中加入墨水后,墨水颜色会随着水的流动逐渐变浅,这里是灌入稀释液,所以离流路入口越远,基质的浓度越高”。

渡边还利用流体模拟验证了能形成什么样的梯度,通过控制稀释液的容量和流速,可以定量改变浓度(图3)。一种稀释液只需几秒钟就能导入,操作简单,还能缩短测量准备时间。

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图3:在微芯片上形成目标物质的浓度梯度。距离流路入口越远,与酶发生反应的物质(基质)浓度越高,活性(荧光强度)越强。可以利用一枚芯片检测试管内是否存在酶,并分析基质浓度和荧光强度的增加速度,能轻松测量单个分子的活性。

新药开发等领域为寻找新药的候选原料,要对数百种蛋白质进行调查,亟需提高实验效率。渡边开发的芯片和浓度梯度形成方法可以为此做出巨大贡献。虽然目前只能形成单向的浓度梯度,但今后将利用电气和磁力等,研究能否用一枚芯片实现各种不同的条件。

简单易用,有助于促进新技术普及

新开发技术的实用化研究也在进行中。渡边说:“要想实际投入使用,需要增加可测量的蛋白质的种类。另外,降低微芯片的制造成本和提高数据分析技术也非常重要。今后打算听取实际使用芯片的研究人员的意见,对技术加以改良,使之作为更加方便易用的技术普及,由此希望能为查明生物分子的功能贡献一份力量,比如明确蛋白质在生物体内的协同作用等”。

今后,如果微芯片实现实用化,并能高效率分析单个蛋白质分子,除用来解开生命现象的奥秘之外,还有望用于新药开发以及疾病的早期发见等。为确立这样的技术,渡边今后会继续积极推进研究。

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制造微芯片的清洁车间。直到试管内的等离子处理步骤都在这里完成。

渡边力也
理化学研究所开拓研究本部主任研究员,2009年修完大阪大学研究生院工程研究科博士课程,获得博士学位(工程)。同年进入大阪大学产业科学研究所担任博士研究员,2011年担任东京大学研究生院工程系研究科助教,2016年升任东京大学研究生院工程系研究科讲师,2018年起任现职。2013~2017年担任先驱研究人员。2017~2019年担任先驱网络研究代表。

出处:JSTnews 2018年12月号
翻译·编辑:JST客观日本编辑部

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