科学研究 - 日本开发出利用光来高密度浓缩微生物活体的蜂窝基板

日本大阪府立大学LAC-SYS研究所在JST的未来社会创造项目中，成功开发出了无需培养，就可在照射激光的条件下低损伤（80～90％存活率）高密度地浓缩生物样本的“蜂窝型光浓缩基板”。

图：只需向蜂窝状微孔基板照射数十秒的激光，就能“大面积”、“高密度”和“高生存率”捕获有用细菌

该研究受具有自然界最密集的六方体“蜂窝”启发，开发出了拥有与微米级细菌匹配的细孔并赋予光发热特性的高分子膜蜂窝基板。通过对大量活细菌进行高密度光浓缩，全球率先成功增强了基板上细菌整体的代谢功能。这项成果将大大促进生物质利用技术的创新。

＜研究背景＞

除了对目标细菌的代谢机理进行基础评价外，从有用细菌的应用和功能最大化的角度来说，对细菌进行活体高密度富集也非常重要。近年来，有用细菌代谢机理的应用非常广泛，包括污水处理、生物乙醇等有用有机化合物的纯化，以及电能的获取等。例如，已知原始细菌地杆菌属和希瓦氏菌属等发电菌会将菌体内氧化还原反应产生的电子有效排放到菌体外，在微生物燃料电池（MFC）领域的应用备受期待。很多研究都在利用这种电子移动机制，设法提高从发电菌获取电子的效率。例如，为增加接触面积，开展了利用多孔碳和石墨烯纳米带等表面积较大的电极的研究，但要采用培养法增加细菌的密度，则需要花费数天以上的时间。

细菌的尺寸从几百纳米（nm）到数微米（μｍ）不等。研究团队认为，如果能制备密集排列1～10μｍ左右细孔的基板，就可以使接触面积最大化。通过在外场远程将大量活细菌捕获到基板上，应该可以实现功能最大化。对于捕获细菌的基板，研究团队将目光放到了在自然界拥有最密集的六方最密堆积结构的蜂窝结构上。需要确保单位面积的容积和强度的器官都采用了大型蜂窝结构，例如包括能以很少的材料储藏大量蜂蜜的蜂窝、增加表面积以感知大量光的昆虫复眼，以及分散来自各个方向的应力得以保护身体的龟壳等。业界也在尝试开发利用蜂窝结构的仿生技术。同时，外场的细菌捕获技术也存在的挑战。采用像光镊那样利用与光电磁场之间的相互作用的方法只能捕获少量细胞，而采用光发热集合法（应用向金属纳米薄膜照射光时产生的光发热效应形成的对流）的话，大部分细菌都会死亡。

研究团队从蜂窝结构的这种优异特性和外场细菌捕获技术获得启发，在基板上制作了具有适合微米级细菌的细孔的蜂窝高分子膜。通过设计光发热效应的导热特性，试着研究了利用物理手段以低损伤快速高密度捕获大量“活”细菌的原理（图1）。

图1：利用蜂窝基板来高密度地光浓缩活菌

＜研究方法＞

研究团队通过以水滴为铸模在聚合物膜中自组织形成蜂窝状细孔，并在其表面形成金属纳米膜（膜厚为50nm），开发出了高效率的光发热基板。向蜂窝基板的隔膜部分照射红外激光（波长为1064nm）产生“光诱导对流”，聚集有鞭毛且具备趋化性的铜绿假单胞菌和不具备趋化性的金黄色葡萄球菌，来评估存活率。另外，作为光集成对象，通过改变激光照射点的数量还可聚集发电菌。然后通过测量向蜂窝基板施加电压产生的电流密度，对其功能进行了评价。热像仪测量显示，照射相同输出功率的激光时，与涂覆以往的光发热集合法采用的平面金纳米薄膜的基板相比，蜂窝基板的温度会加倍升高（图2）。此外，研究团队还结合电磁响应理论和热流体力学理论解析了对流。结果显示，蜂窝基板表面会产生朝向激光照射点的水平对流，而细孔内则产生涡状对流，由此验证了活细菌也能被高密度捕获（图1B右）。

图2：蜂窝基板与以往的平面基板的光发热效果比较

＜研究成果＞

下面介绍一下利用蜂窝光浓缩基板，通过激光照射捕获细菌的结果。目标细菌采用了革兰阴性菌——铜绿假单胞杆菌和革兰阳性菌——金黄色葡萄球菌。图1C上方是以40ｍW的激光输出在蜂窝高分子膜上进行光发热集合时的活菌（绿色）和外膜受损细菌（红色）的荧光示意图。从图中可以看出，细菌在高达100μｍ的大范围内密集地聚集在蜂窝高分子膜上，几乎没有死菌（红色）。另外还确认，照射激光后将聚集了细菌的基板浸入培养液中培养时，细菌会增殖。作为对照实验，向利用常规方法制作的平坦金属纳米平面基板照射激光发现，使用70ｍW以下的激光不会产生气泡，而照射129ｍW的高功率激光时，细菌虽然聚集到了激光照射点附近，但聚集范围比较小，存活率也只有约16％，大部分细菌均死亡。图3是在10ｍW～70ｍW的范围内改变照射各细菌的激光功率，根据捕获的细菌的荧光染色图像估算捕获密度与存活率的关系。可以看出，铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌在特定的激光功率范围内均能保持80～90％的高存活率，并被高密度捕获到各蜂窝细孔中。

图3：多种细菌的光集成捕获密度与存活率

为评估高密度捕获的细菌功能，研究团队以发电菌之一的希瓦氏菌为对象进行了实验。图4是以光集成这种细菌的蜂窝基板为负极，以Pt基板为正极，以Ag/AgCl为参比电极的三电极体系中边加载偏压边测量电流。已知希瓦氏菌会分解有机物释放电子，因此添加乳酸钠作为有机物，在易于提取电子的厌氧条件下进行了测量。向各个点依次照射20秒的激光发现，照射点的数量增至25点、50点和100点的话，电流密度会随着照射点数增加1～2位数。研究团队在不会引起细胞分裂的短时间内测量了电流，电流密度的增大被认为是随着激光照射而高密度聚集的希瓦氏菌引起的。