教育 - 只需唾液！可同时检测流感病毒和新冠病毒的试剂盒

隅田泰生

日本SUDx-Biotec公司代表董事兼鹿儿岛大学研究生院理工学研究科教授

概要

SUDx-Biotec公司是为了将2003年10月至2006年9月由本人担任国立研究开发法人科学技术振兴机构（JST）“糖芯片实用化” 预创业项目带头人期间所取得的成果转化成产品而成立的鹿儿岛大学初创企业，也是JST扶持创办的第51家初创企业。

细胞表面存在名为糖链的、含有丰富信息的纳米尺寸链状糖。糖链通过与特定的蛋白质或者其他糖链的相互作用向细胞传递信息来参与免疫等生命活动。另外科学家还发现，糖链与细胞的癌变和病毒感染等也有关系，因此糖链在生命科学领域颇受关注。不过，研究糖链需要在分子水平进行研究，获得结构明确的糖链也需要花费大量的人力和费用，因此研究常常无法顺利推进。

为解决这个问题，并推进糖链科学研究的飞跃进步，我们开发出了将结构明确的糖链固定到纳米级金属（金）芯片上的生物器件“糖芯片”和“糖链固定化金纳米颗粒”两种工具，并利用这两种工具成功捕获、浓缩及纯化了病毒颗粒。我们还通过与PCR（聚合酶链反应）相结合的手法，成功开发出了高精度快速检测流感病毒、诺如病毒、疱疹病毒及猪流行性腹泻病毒等人与家畜罹患的病毒性疾病的诊断方法。另外，针对2020年世界大流行的新冠病毒（SARS-CoV-2），我们还开发出了采用该技术的体外诊断试剂盒，2020年6月SUDx SARS-CoV-2 detection kit被纳入医保，10月份，能以唾液为样本无侵袭同时检测新冠病毒和流感病毒的SGNP nCoV/FluPCR检测试剂盒通过了药械审批，并于2020年12月开始上市销售。

关于流感诊断

戴口罩、洗手、避免去人多的地方、接种疫苗、提高免疫力等，我们从小就学过的这些与新冠对策基本相同的流感预防对策，尽管如此每年还是会发生流感，所以我们就想应该把自己的技术用于检测试剂盒上。

流感的诊断在日本一般通过基于免疫层析法的抗原蛋白检测法来进行。不过，这种方法的灵敏度不够高，很多时候必须发病24小时后才能被确诊为阳性。另外，检测样本主要使用含有大量病毒抗原、但具有侵袭性的鼻拭子。不少人都有过做流感检查时体验了一番苦痛后，被告知为阴性，后来又病情加重的痛苦经历，甚至有人因此留下了心理阴影，不愿意再接受检查，结果因为没有服用抗流感药物而使得病情加重。

为解决这个问题，我们开发了“无痛且超灵敏”的检测法。在公司官网上还发布了相关视频（利用唾液的无痛流感PCR检测），虽然最好的了解方法就是直接去看视频，我这里就只简单地为大家介绍一下。

细胞表层由于被糖链覆盖，所以病毒看不到细胞表层的蛋白质。因此，病毒首先会吸附到糖链上，然后，将糖链作为真正的受体（流感的受体是含唾液酸的糖链）入侵感染细胞。如图1所示，我们首先利用糖芯片确定了病毒吸附的糖链，并将糖链固定到比病毒还小的金纳米颗粒上，制备了SGNP（糖链固定化金纳米颗粒）。将SGNP加入病毒溶液中，SGNP会吸附到病毒上捕获病毒。被捕获的病毒会变重，即使利用低速离心机也能获得含病毒颗粒的沉淀物。通过向沉淀物中加入少量表面活性剂溶液，或者加水加热，可以破坏病毒颗粒，析出里面的RNA（核糖核酸）。收集病毒颗粒时会进行粗提纯，因此析出的RNA拥有足够的纯度，可直接用于RT-PCR（逆转印聚合酶链反应）来检测病毒RNA。如果使纳米颗粒拥有磁性的话还可以进行磁性分离，我们针对这种情况开发了添加诱导材料磁性微颗粒的方法，拿到样本后只需3分钟左右即可制作出用于RT-PCR的RNA溶液。

图1：采用糖链固定化纳米颗粒的高灵敏度病毒检测法：捕获、浓缩及纯化病毒颗粒

表1是我们的检测法首次实施临床研究时的部分结果。这是在鹿儿岛市内的小型医院或大学附属医院利用疑似流感患者的鼻拭子和快速检测试剂盒（免疫层析法）检测时获得的结果，以及从相同患者身上采集约0.5mL唾液，通过SGNP法提取RNA并用RT-PCR法检测（以下简称SGNP/PCR法）时获得的结果。比较各种结果可见，SGNP/PCR法的阳性率（灵敏度）远远高于前者。令人惊讶的是，快速检测试剂盒判断为阴性的疑似流感患者有50％以上都是流感阳性。我们连续实施了约5年的临床研究，2017年，在厚生劳动省的先进医疗会议上，“通过采用糖链纳米技术的高灵敏度病毒检测法为传染病诊疗及院内感染对策提供支援”被纳入先进医疗A分类。

在先进医疗A分类的研究中，主要研究目的是调查此前不清楚的、SGNP/PCR法与快速检测试剂盒相比性能尤其优异的发病后时间段。2018～2019年的流感季在I医院实施的检测中，发病后24小时内用快速检测试剂盒检测呈阴性的46名疑似流感患者有17人分别在唾液中检测出了甲型（9人）、乙型（7人）和甲+乙型流感病毒（复合感染1人）。而在M医院，194名疑似流感患者中有64人（甲型53人、乙型9人、复合感染2人）从唾液中检测出了流感病毒。这表明，SGNP/PCR法即使发病时间不到24小时，也能准确检测出流感患者。另外，将30位患者的唾液稀释液用于采用MDCK细胞的病毒分离培养实验发现，精度（阳性一致率，13/13）和特异性（阴性一致率，17/17）均完全相同，这表明SGNP/PCR法是可以检测感染性病毒的方法。

表1：2011-2012年流感季实施的临床研究的结果：利用疑似流感患者鼻拭子的快速检测试剂盒的检测结果与利用唾液的SGNP/PCR法的检测结果比较

根据以上结果，我们与独立行政法人医药品医疗机器综合机构（PMDA）协商后，实施了临床性能试验。作为以患者唾液为样本的SGNP/PCR法的对照试验，由于此前获批的流感体外诊断药物没有以唾液为样本的例子，因此决定利用来自相同患者鼻腔分泌物的MDCK细胞进行病毒分离培养。很多论文和报告都显示鼻腔分泌物中含有的病毒量更多，因此一直担心该比较试验能否获得90％以上的一致率，2019年12月，我们邀请鹿儿岛市内的四家诊所和医院配合，启动了临床性能试验。受新冠疫情影响，从2020年3月开始基本再没收集到样本，经PMDA批准，我们比较了病例等数据全部齐全的463名患者的样本数据。幸运的是，临床性能试验成功结束，精度达到93％，特异性达到95％，整体的一致率达到95％

关于新冠病毒检测

2020年2月，先进医疗A类研究的联合研究人员田岛医生所在的滨松医疗中心收治了一位新冠患者。我们虽然没有处理人类冠状病毒的经验，但知道猪类冠状病毒（猪流行性腹泻病毒）与流感病毒一样，也可以利用SGNP浓缩，因此与田岛医生商量后启动了SARS-CoV-2的临床研究。田岛医生采集了患者的唾液和咽拭子或者鼻咽拭子2种样本，咽拭子或鼻咽拭子按照国立感染症研究所制定的操作规范，利用Qiagen法在滨松环境保健中心提取RNA，实施了PCR检测。而唾液利用流感检测试剂盒浓缩病毒后，提取RNA送到了鹿儿岛，我们对美国CDC（疾病控制与预防中心）和国立感染症研究所推荐的引物和探针进行部分改良后实施了PCR检测。检测结果显示，这位患者在住院第35天时唾液中依然存在SARS-CoV-2，唾液转为阴性后，鼻咽拭子也转为阴性，最终在第42天出院。这项研究表明，使用早上刚起床时的唾液作为样本，可以获得与鼻咽拭子相同的结果。

之后我们利用在滨松医疗中心做过检测的疑似新冠患者的唾液和鼻咽拭子继续进行临床研究。并将滨松医疗中心的鼻咽拭子检测结果作为对照试验，评估了SGNP/PCR法。结果显示，利用鼻咽拭子时，精度（10/10）和特异性（15/15）均100％一致，利用唾液时，精度（9/10）90％一致，特异性（15/15）100％一致。这些结果提交给厚生劳动省后，最终作为获得紧急使用授权的研究试剂“SUDx SARS- CoV-2 detection kit”于2020年6月10日被纳入医保。

药械申请

由于“SUDx SARS- CoV-2 detection kit”的流感临床性能试验精度和特异性均超过90％，因此2020年6月24日向PMDA咨询药械（关于确保药品和医疗器械等的品质、有效性及安全性等的法律：《药械法》）申请相关事宜时得到的意见是：463个病例均无问题，可以申请。在剩下的时间里，我们又向PMDA报告说目前正考虑开发可与上述被纳入医保的新冠病毒检测试剂盒组合，利用唾液同时检测流感和新冠的检测系统，PMDA听后建议，为应对2020年的流感季，最好先对同时检测系统进行药械申请。于是，在约2周后的全面咨询中，我们向PMDA报告了采用人工模拟样本的方案，得到了PMDA的同意，人工模拟样本是将灭活SARS-CoV-2以及甲型和乙型流感的阳性对照物与唾液混合制备的。厚生劳动省的相关人员也参加了那次咨询，希望我们考虑量产事宜。

我们选出同时检测3种病毒的酶、探针及多重色素等之后，利用120份人工模拟样本进行了试验，并对每份模拟样本分别实施了新冠、甲型流感和乙型流感检测，作为对照试验进行了评估。结果显示，精度（105/105）和特异性（15/15）均达到100％。整理这些结果后，于9月份为“SGNP nCoV/Flu PCR检测试剂盒”进行了药械申请。另外，不仅是唾液，还利用混合鼻拭子及鼻咽拭子的人工模拟样本进行了试验，最终，作为以唾液、鼻拭子或者鼻咽拭子为样本，可同时检测新冠和流感的体外诊断药物于10月23日通过了药械审批，之后于11月10日完成定价，纳入了医保。

我们的试剂盒是唯一可以利用唾液同时检测流感和新冠，目前应该还没有其他同类试剂盒正式获批。唾液是不会给患者造成痛苦和不适的样本，而且可以根据医生的在线指导自我采集。

避免出现假阳性的检测方法

由于SGNP/PCR法首先收集病毒颗粒，因此我们认为利用该方法检测得到的病毒量可以解释患者的病况。为证明这一点，我们对新冠病毒住院患者实施了后续实验。参考上述滨松医疗中心的例子，请鹿儿岛市内的T医院采集住院患者早上刚起床时的唾液，并与SUDx SARS-CoV-2 detection kit的样本稀释保存液混合，在4℃下保存。之后我们利用Qiagen法（Boom法）从该溶液中提取和纯化SARS-CoV-2的RNA，再利用SGNP法收集病毒颗粒，提取RNA，然后利用相同的RT-PCR试剂和PCR检测仪，按照相同的操作规范进行检测，并作为原始溶液中的病毒浓度进行了定量。

请看下面两个病例。如图2所示，患者TCH-59住院第二天时，利用SGNP法（图中蓝条）和Qiagen法（图中灰条）均检测出唾液中存在高浓度的RNA，SGNP法在住院第五天时检测到的RNA浓度略有升高，但整体仍呈逐日下降的趋势，到第六天以后已经完全检测不到。而Qiagen法检测的RNA浓度在住院前十天基本没有变化。患者的病情逐日好转，到第七天时已经完全没有症状。患者TCH-61住院第二天时利用SGNP法检测出非常少量的RNA，而利用Qiagen法没有检测出。原因应该是，单纯计算的话，SGNP法将样本浓缩了25倍，而Qiagen法只浓缩了约2.5倍。第三天SGNP法的检测结果没有变化，但第四天RNA浓度开始升高。Qiagen法第三天检测到了RNA，第四天检测到的RNA浓度也与前一天基本相同。第五天和第六天是周末，所以没采集到样本，第七天SGNP法和Qiagen法检测到的RNA浓度均升高，之后这位患者的病情恶化，被转去了专科医院。

如患者TCH-59那样，由于Qiagen法无法区分病毒片段中的RNA和病毒颗粒中的RNA，康复期的患者进行PCR检测时会出现假阳性，可能引起混乱。因此，住院患者好像基本不做PCR检测。即使不检测，如果像患者TCH-59那样，住院10天且已经没有任何症状，患者也可以出院。另一方面，患者TCH-61利用Qiagen法和SGNP法都获得了可以预测病情恶化的数据。以上结果表明，像SGNP法那样，检测结果与病情吻合的PCR检测法非常有效。除此之外还有很多病例，目前正在整理论文。在所有病例中，利用SGNP法量化的RNA都比Qiagen法更能解释病情的康复情况，有望进一步降低假阳性检测。